2 × Pfu PCR Mix

Isang-1 na Template

■ Naglalaman ang template ng mga impurities ng protina o Taq inhibitors, atbp .—— Linisin ang template ng DNA, alisin ang mga impurities ng protina o i-extract ang template ng DNA na may mga kit ng paglilinis.

■ Ang denaturation ng template ay hindi kumpleto —— Naaangkop na taasan ang temperatura ng denaturation at pahabain ang oras ng denaturation.

■ Pagwasak ng template —— Muling ihanda ang template.

A-2 Panimula

■ Hindi magandang kalidad ng mga primer ——Re-synthesize ang panimulang aklat.

■ Pangunahin na pagkasira ng katawan ——Nag-iipon ng mataas na konsentrasyon ng mga primer sa maliit na dami para sa pangangalaga. Iwasan ang maraming pagyeyelo at pagkatunaw o pangmatagalang 4 ° C cryopreserve.

■ Hindi wastong disenyo ng mga primer (hal. Haba ng panimulang hindi sapat, malabo na nabuo sa pagitan ng mga primer, atbp.) -Redesign primers (iwasan ang pagbuo ng primer dimer at pangalawang istraktura)

A-3 Mg²⁺konsentrasyon

■ Mg²⁺ masyadong mababa ang konsentrasyon —— Maayos na taasan ang Mg²⁺ konsentrasyon: I-optimize ang Mg²⁺ konsentrasyon ng isang serye ng mga reaksyon mula 1 mM hanggang 3 mM na may agwat na 0.5 mM upang matukoy ang pinakamainam na Mg²⁺ konsentrasyon para sa bawat template at panimulang aklat.

A-4 Temperatura ng pag-Annealing

■ Ang mataas na temperatura ng pagsusubo ay nakakaapekto sa pagbubuklod ng panimulang aklat at template. —— Bawasan ang temperatura ng pagsusubo at i-optimize ang kondisyon na may gradient na 2 ° C.

A-5 Oras ng pagpapalawak

■ Maikling oras ng extension —— Taasan ang oras ng extension.

Phenomena: Ipinapakita rin ng mga negatibong sample ang mga target na banda ng pagkakasunud-sunod.

A-1 Contamination ng PCR

■ Tumawid sa kontaminasyon ng pagkakasunud-sunod ng target o mga produktong pampalaki —— Maingat na hindi pipet ang sample na naglalaman ng pagkakasunud-sunod ng target sa negatibong sample o ibubuhos ang mga ito mula sa centrifuge tube. Ang mga reagent o kagamitan ay dapat na autoclaved upang maalis ang mga umiiral na mga nucleic acid, at ang pagkakaroon ng kontaminasyon ay dapat na matukoy sa pamamagitan ng mga eksperimentong negatibong kontrol.

■ Reagent na kontaminasyon ——I -quote ang mga reagent at iimbak sa mababang temperatura.

A-2 Punong Punongr

■ Mg²⁺ masyadong mababa ang konsentrasyon —— Maayos na taasan ang Mg²⁺ konsentrasyon: I-optimize ang Mg²⁺ konsentrasyon ng isang serye ng mga reaksyon mula 1 mM hanggang 3 mM na may agwat na 0.5 mM upang matukoy ang pinakamainam na Mg²⁺ konsentrasyon para sa bawat template at panimulang aklat.

■ Hindi wastong disenyo ng panimulang aklat, at ang pagkakasunud-sunod ng target ay may homology na may pagkakasunud-sunod na hindi target. ——Mga muling disenyo ng disenyo.

Phenomena: Ang mga PCR amplification band ay hindi naaayon sa inaasahang laki, alinman sa malaki o maliit, o kung minsan ay kapwa natukoy na mga partikular na amplification band at mga hindi partikular na amplification band.

A-1 Panimulang Gabay

■ Hindi magandang pagtutukoy ng primer

——Re-disenyo ng panimulang aklat.

■ Masyadong mataas ang konsentrasyon ng panimulang aklat —— Maayos na taasan ang temperatura ng denaturation at pahabain ang oras ng denaturation.

A-2 Mg²⁺ konsentrasyon

■ Ang Mg²⁺ masyadong mataas ang konsentrasyon —— Maayos na bawasan ang konsentrasyon ng Mg2 +: I-optimize ang Mg²⁺ konsentrasyon ng isang serye ng mga reaksyon mula 1 mM hanggang 3 mM na may agwat na 0.5 mM upang matukoy ang pinakamainam na Mg²⁺ konsentrasyon para sa bawat template at panimulang aklat.

A-3 Thermostable polymerase

■ Labis na halaga ng enzyme —— Bawasan nang naaangkop ang halaga ng enzyme sa agwat ng 0.5 U.

A-4 Temperatura ng pag-Annealing

■ Ang temperatura ng pagsusubo ay masyadong mababa —— Naaangkop na dagdagan ang temperatura ng pagsusubo o gamitin ang dalawang yugto na pamamaraan ng pagsusubo.

A-5 PCR cycle

■ Napakaraming mga cycle ng PCR —— Bawasan ang bilang ng mga cycle ng PCR.

A-1 Panimulang Gabay——Mahihirap na detalye --— Muling idisenyo ang panimulang aklat, baguhin ang posisyon at haba ng panimulang aklat upang mapagbuti ang pagiging tiyak nito; o magsagawa ng nakapugad na PCR.

A-2 Template DNA

——Ang dalisay na template ay hindi puro ——Linisin ang template o kumuha ng DNA na may mga kit sa paglilinis.

A-3 Mg²⁺ konsentrasyon

——Mg²⁺ masyadong mataas ang konsentrasyon —— Maayos na bawasan ang Mg²⁺ konsentrasyon: I-optimize ang Mg²⁺ konsentrasyon ng isang serye ng mga reaksyon mula 1 mM hanggang 3 mM na may agwat na 0.5 mM upang matukoy ang pinakamainam na Mg²⁺ konsentrasyon para sa bawat template at panimulang aklat.

A-4 dNTP

——Ang konsentrasyon ng mga dNTP ay masyadong mataas —— Bawasan ang konsentrasyon ng dNTP nang naaangkop

A-5 temperatura ng pagsusulit

—— Masyadong mababa ang temperatura ng pagsusubo —— Naaangkop na taasan ang temperatura ng pagsusubo

A-6 na Pag-ikot

—— Masyadong maraming mga cycle ——Optimize ang bilang ng cycle

Ang unang hakbang ay upang piliin ang naaangkop na polymerase. Ang regular na Taq polymerase ay hindi maaaring mag-proofread dahil sa kakulangan ng aktibidad na 3'-5 'exonuc please, at ang hindi pagtutugma ay lubos na mabawasan ang kahusayan ng extension ng mga fragment. Samakatuwid, ang regular na Taq polymerase ay hindi mabisang mapalakas ang mga fragment ng target na mas malaki sa 5 kb. Ang Taq polymerase na may espesyal na pagbabago o iba pang mataas na fidelity polymerase ay dapat mapili upang mapabuti ang kahusayan ng extension at matugunan ang mga pangangailangan ng mahabang fragment amplification. Bilang karagdagan, ang pagpapalaki ng mahabang mga fragment ay nangangailangan din ng kaukulang pagsasaayos ng disenyo ng panimulang aklat, oras ng denaturation, oras ng extension, buffer pH, atbp Karaniwan, ang mga primer na may 18-24 bp ay maaaring humantong sa mas mahusay na ani. Upang maiwasan ang pinsala sa template, ang oras ng denaturation sa 94 ° C ay dapat na mabawasan sa 30 sec o mas mababa bawat cycle, at ang oras na tumaas ang temperatura sa 94 ° C bago ang amplification ay dapat mas mababa sa 1 minuto. Bukod dito, ang pagtatakda ng temperatura ng extension sa halos 68 ° C at pagdidisenyo ng oras ng extension ayon sa rate ng 1 kb / min ay maaaring matiyak na mabisang pagpapalaki ng mahabang mga fragment.

Ang rate ng error ng amplification ng PCR ay maaaring mabawasan sa pamamagitan ng paggamit ng iba't ibang mga polymerase ng DNA na may mataas na katapatan. Kabilang sa lahat ng mga Taq DNA polymerases na natagpuan sa ngayon, ang Pfu enzyme ay may pinakamababang rate ng error at pinakamataas na katapatan (tingnan ang kalakip na talahanayan). Bilang karagdagan sa pagpili ng enzyme, ang mga mananaliksik ay maaaring karagdagang bawasan ang rate ng pagbago ng PCR sa pamamagitan ng pag-optimize ng mga kondisyon ng reaksyon, kabilang ang pag-optimize ng komposisyon ng buffer, konsentrasyon ng termostable polymerase at pag-optimize ng numero ng cycle ng PCR.